Durante los últimos años, las características fisiológicas de la biota que habita el ambiente marino han despertado interés, debido a su potencial uso biotecnológico en diversas áreas (Feng et al. 2020; Kim et al. 2021). En Argentina, el ecosistema marino presenta no solo una gran extensión, sino también una alta biodiversidad. Sin embargo, los microorganismos que habitan estos ecosistemas han sido poco estudiados y su potencial biotecnológico, escasamente explorado (Dionisi et al. 2012).

Las bacterias ácido lácticas (BAL) se han utilizado para elaborar y conservar alimentos desde el comienzo de la civilización, por la capacidad de producir ácidos orgánicos que logran su preservación, así como en el desarrollo de características organolépticas. Las BAL pueden presentarse en forma fortuita como microbiota natural de los alimentos o incorporarse de manera controlada en fermentaciones industriales como cultivos iniciadores (Łepecka et al. 2023). El estudio en profundidad del metabolismo de las BAL ha permitido seleccionar cepas con características funcionales para su aplicación en alimentos (Kuda et al. 2014; Lin et al. 2018). El término “alimento funcional” se introdujo por el Gobierno de Japón a mediados de 1980 (Granato et al. 2020) y se define como productos utilizados como parte de una dieta normal con efectos más allá de sus funciones nutricionales básicas. El mercado de alimentos funcionales está en continuo crecimiento, en relación con productos dirigidos a la salud gastrointestinal, enfocado, particularmente, en los prebióticos y probióticos (Annuziata & Vecchio, 2013).

El desbalance entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) y/o radicales libres y la dificultad de su eliminación por sistemas antioxidantes genera el estrés oxidativo de un organismo (Łepecka et al. 2023). Las modificaciones por reacciones de oxidación que sufren el ADN, proteínas, lípidos y otras moléculas pequeñas por ROS desempeñan un papel importante en el desarrollo de enfermedades comunes y afecciones degenerativas relacionadas con la edad (Wen et al. 2013; Kuda et al. 2014).

Durante los últimos años, ha tomado un especial interés la búsqueda de nuevos antioxidantes que sean seguros para su uso en alimentos; en particular las BAL y sus metabolitos se han reconocido como fuentes efectivas. La mayoría de las BAL tiene sistemas que eliminan los radicales libres de oxígeno, reducen su acumulación e incluso previenen su formación en el intestino, disminuyendo el estrés oxidativo (Łepecka et al. 2023).

El litoral marino de la Argentina constituye una fuente de BAL, provenientes de distintos vertebrados e invertebrados, que exhiben propiedades biotecnológicas aplicables en la industria alimentaria, tales como actividad antimicrobiana (Marguet et al. 2011; Sosa et al. 2022), producción de bioemulsificantes (Gianni de Carvalho et al. 2019; Lara et al. 2020), características probióticas (Sequeiros et al. 2010), entre otras. A lo largo de los últimos años, se ha profundizado el estudio de la capacidad antioxidante de BAL provenientes de organismos terrestres y alimentos fermentados o sin procesar; no obstante, es escasa la información sobre cepas de origen marino. En el presente estudio, se evaluó la capacidad antioxidante in vivo e in vitro de cepas de BAL bacteriocinogénicas aisladas de invertebrados y peces marinos de la costa de la provincia de Chubut (Argentina), para su posterior selección como cultivos iniciadores en alimentos funcionales.

Se seleccionaron 16 cepas de BAL provenientes de invertebrados y peces marinos (Cuadro 1) de la costa de la provincia de Chubut (Patagonia-Argentina), sobre la base de su actividad antimicrobiana contra patógenos o contaminantes de alimentos de interés para la industria pesquera. Se utilizaron las cepas Enterococcus hirae 106, 107, 108, 463 y 471; E. faecium 135, 452, 459, 465 y 468, y E. mundtii 278 (Sosa et al. 2022); Lactococcus lactis Tw11, 12, 34 y 35 (Vallejo et al. 2009); y E. mundtii Tw56 (Schelegueda et al. 2015), pertenecientes al cepario del Laboratorio de Biotecnología Bacteriana (LBB), Cátedra de Biología Celular y Molecular, FCNyCS, UNPSJB- Sede Trelew.

Cuadro 1

Cepa	Organismos	Origen	Lugar de colección
Enterococcus mundtii Tw56	Odonthesthes platensis (pejerrey panzón)	Intestino	Puerto Rawson (-43.33, -65.05)
E. hirae 106	Hemiodema spectabilis (pepino de mar)	Intestino	Playa Unión - Rawson (-43.31, -65.04)
E. hirae 107	H. spectabilis	Intestino	El sombrerito - Rawson (-43.25, -64.98)
E. hirae 108	Forcipulatida (estrella de mar)	Intestino	El sombrerito - Rawson
E. faecium 135	Forcipulatida	Intestino	Playa Unión - Rawson
E. mundtii 278	H. spectabilis	Intestino	Playa Unión - Rawson
E. faecium 452	Mytilus edulis platensis (mejilón)	Intestino	Golfo San Jorge - Comodoro Rivadavia (-45.84, -67.47)
E. faecium 459	M. edulis platensis	Intestino	Golfo San Jorge - Rada Tilly (-45.92, -67.55)
E. hirae 463	M. edulis platensis	Intestino	Golfo San Jorge - Comodoro Rivadavia
E. faecium 465	M. edulis platensis	Intestino	Playa Magagna - Rawson (-44.90, -65.60)
E. faecium 468	M. edulis platensis	Intestino	Caleta Carolina - Camarones (-44.90, -65.60)
E. hirae 471	M. edulis platensis	Intestino	Golfo San Jorge - Rada Tilly
Lactococcus lactis Tw11	O. platensis	Tegumento	Playa Magagna - Rawson
L. lactis Tw12	O. platensis	Tegumento	Playa Magagna - Rawson
L. lactis Tw34	O. platensis	Intestino	Playa Magagna - Rawson
L. lactis Tw35	O. platensis	Tegumento	Playa Magagna - Rawson

Para los experimentos subsecuentes, las cepas se cultivaron en 2 ml de caldo Man Rogosa Sharpe (MRS) (Biokar, Francia) a 35°C, durante 18 h sin agitación. Las células intactas se obtuvieron mediante centrifugación a 2 000 g durante 15 min y lavado con buffer PBS, procedimiento realizado dos veces. La capacidad antioxidante en células intactas se determinó in vitro, con la técnica de actividad antioxidante por reducción de 2,2-difenil-1-picrihidrazilo (DPPH), reacción de secuestro de radicales oxidrilos y la capacidad antioxidante reductora de iones cúpricos (CUPRAC). Además, se evaluó in vivo el efecto protector de las BAL contra el peróxido de hidrógeno, por medio del uso de Saccharomyces cerevisiae como modelo eucariota.

Los microorganismos que presentan capacidad antioxidante, mediante la producción de metabolitos y/o presencia de componentes en su superficie celular, podrían disminuir o anular el efecto negativo de los ROS (Bhagwat & Annapure, 2019). En este estudio, se evaluaron diferentes ensayos in vitro. En el Cuadro 2, se observan los porcentajes de barrido de DPPH y radicales oxidrilos, comprendidos entre un 15-37.5% y 13.361.9%, respectivamente.

Cuadro 2

Cepas	Actividad antioxidante
	Tasa de barrido de DPPH (%)	Tasa de barrido de radicales oxidrilo (%)
Enterococcus mundtii Tw56	21.2 ± 1.8bcd	20.4 ± 2.6abc
E. hirae 106	37.5 ± 5.1f	28.4 ± 3.4cde
E. hirae 107	17.2 ± 1.5abc	40.9 ± 5.0ef
E. hirae 108	36.8 ± 4.7f	44.8 ± 5.6f
E. faecium 135	26.4 ± 1.4de	21.1 ± 5.1abcd
E. mundtii 278	35.2 ± 4.5f	22.7 ± 3.3bcd
E. faecium 452	22.4 ± 1.1cd	61.9 ± 4.2g
E. faecium 459	36.0 ± 3.7f	33.9 ± 1.8e
E. hirae 463	20.1 ± 1.5a	32.8 ± 5.1cde
E. faecium 465	32.0 ± 1.6ef	31.9 ± 6.3e
E. faecium 468	23.1 ± 2.3cd	21.7 ± 6.8bcd
E. hirae 471	21.4 ± 0.6bcd	29.0 ± 7.5de
Lactococcus lactis Tw11	21.5 ± 2.9bcd	13.3 ± 1.0a
L. lactis Tw12	18.6 ± 2.0abc	28.7 ± 7.9de
L. lactis Tw34	15.7 ± 1.2ab	17.4 ± 1.1ab
L. lactis Tw35	25.2 ± 0.8d	17.8 ± 3.1ab

La evidencia de actividad antioxidante por el método de DPPH se observa por medio de la interacción de radicales libres con compuestos de carácter antioxidante donantes de protones, que ocasiona un descenso en la absorbancia con respecto al control (Bhagwat & Annapure, 2019). A partir de los resultados obtenidos de DPPH, se pueden agrupar las siguientes cepas, en función de su mayor capacidad antioxidante: E faecium 459 y 465, E. mundtii 278 y E. hirae 106 y 108, todas ellas provenientes de invertebrados marinos, que presentan diferencias significativas con las demás cepas pertenecientes al género (P ≤ 0.05). En el género Lactococcus, la cepa L. lactis Tw 35, proveniente del tegumento de Odonthesthes platensis, exhibe una mayor capacidad antioxidante (P ≤ 0.05). Las restantes BAL evaluadas presentan variaciones en los resultados, independientemente de la cepa y el organismo de origen del aislamiento.

Resultados similares fueron obtenidos por Bhagwat & Annapure (2019), quienes evaluaron la actividad antioxidante por medio de la técnica de DPPH en cepas de Enterococcus de origen humano, con valores variables para las especies evaluadas. A diferencia de lo obtenido en este estudio, las cepas evaluadas por Rezaei et al. (2020) exhiben una capacidad antioxidante entre 40-60% para Lactococcus lactis y de 58% para Enterococcus faecium aislados de leche de camello.

La reacción de Fenton se basa en la oxidación de iones Fe²⁺ a Fe³⁺ mediada por la acción del peróxido de hidrógeno, lo cual da como resultado radicales OH^•. Estas especies reactivas del oxígeno ocasionan daños en el ADN y producen la peroxidación de lípidos (Lin et al. 2018). A partir del análisis de los datos de barrido de radicales oxidrilos, se destaca la cepa E. faecium 452, aislada de Mytilus edulis platensis, que presentó un 62% de actividad antioxidante, significativamente diferente al resto de las especies estudiadas pertenecientes al género Enterococcus0.05). Este resultado supera al porcentaje obtenido por Lin et al. (2018) para cepas de Lactobacillus plantarum, con valores de secuestro de radicales oxidrilos en un rango entre 7.08-49.60%, y Pediococcus pentosaceus, de 26.45%. También podemos destacar como microorganismos promisorios a E. hirae 107 con actividad antioxidante de un 40.9% y E. hirae 108 con 44.8%, aisladas de pepino de mar (Hemiodema spectabilis) y de estrella de mar (orden Forcilulatida), respectivamente. En relación con el género Lactococcus, se destaca L. lactis Tw 12, que exhibió un porcentaje de secuestro de radicales oxidrilos de 28.7%, valor notablemente distinto, comparado con las demás cepas pertenecientes al género (P ≤ 0.05).

Se debe resaltar que L. lactis Tw 35 mostró mayor capacidad antioxidante en DPPH, comparado con integrantes de su mismo género; sin embargo, se obtuvo uno de los valores más bajos cuando se utilizó la técnica de secuestro de radicales oxidrilos. En las demás cepas ensayadas, se obtuvieron valores variables, independientemente del género y de la especie, como también del organismo del que fueron aislados.

En el Cuadro 3, se observan los resultados de capacidad antioxidante determinados por el método CUPRAC. Las cepas exhiben una capacidad antioxidante entre 0.2330.551 equivalentes mmol de ácido ascórbico*ml de suspensión^-1. En el género Enterococcus, se destacan las cepas de E. mundtii Tw56 aislada de O. platensis, E. hirae 108 y E. faecium 465, ambas provenientes de invertebrados marinos; mientras que para el género Lactococcus, la cepa L. lactis Tw12 aislada de O. platensis exhibió la mayor capacidad antioxidante (P ≤ 0.05). Las restantes cepas de BAL evaluadas presentan variaciones en los resultados, independientemente del género, de la especie y del organismo de aislamiento (peces o invertebrados).

Los resultados obtenidos equivalen al promedio y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Las medias con diferentes letras indican diferencias significativas (P ≤ 0.05).

El ensayo CUPRAC es un método utilizado para el análisis de la actividad antioxidante de matrices

Cuadro 3

Cepas	Capacidad antioxidante (Eq. mmol ácido ascórbico.ml de suspensión-1)
Enterococcus mundtii Tw56	0.472 ± 0.036gh
E. hirae 106	0.429 ± 0.055efg
E. hirae 107	0.421 ± 0.008defg
E. hirae 108	0.441 ± 0.123fg
E. faecium 135	0.406 ± 0.018cdefg
E. mundtii 278	0.417 ± 0.035cdefg
E. faecium 452	0.387 ± 0.046cdef
E. faecium 459	0.352 ± 0.055bc
E. hirae 463	0.360 ± 0.030cd
E. faecium 465	0.511 ± 0.063h
E. faecium 468	0.411 ± 0.083cdefg
E. hirae 471	0.372 ± 0.008cde
Lactococcus lactis Tw11	0.233 ± 0.013a
L. lactis Tw12	0.383 ± 0.051cdef
L. lactis Tw34	0.280 ± 0.028a
L. lactis Tw35	0.274 ± 0.041ab

Los resultados obtenidos equivalen al promedio y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Las medias con diferentes letras indican diferencias significativas (P ≤ 0.05).

alimentarias y extractos biológicos. Está basado en una transferencia simple de electrones y mide el poder reductor de los compuestos antioxidantes para convertir los iones Cu2+ a Cu+. Este es considerado una variación del ensayo FRAP, con el cual se evalúa la reducción del ion Fe+3 a Fe+2 (Shahidi & Zhong, 2015). Mu et al. (2019) realizaron un ensayo con células intactas, mediante la técnica FRAP, para examinar la actividad antioxidante de la cepa L. plantarum Y44. No obstante, sus resultados no serían comparables con los obtenidos en este trabajo, debido a las diferencias entre los iones metálicos como también al pH del medio utilizado para la reacción, ya que la técnica FRAP es efectuada en un medio ácido (pH = 3.6) y el ensayo CUPRAC es llevado a cabo a pH neutro. Este último podría simular de mejor manera la acción fisiológica de la actividad antioxidante (Özyürek et al. 2011).

Las BAL, como otros microorganismos, presentan la capacidad de capturar iones metálicos, que se unen a la pared celular o polisacáridos extracelulares, mediante la adsorción, cambios iónicos, formación de complejos, quelación o microprecipitación. El secuestro de iones metálicos ocurre por biosorción (la unión de iones metálicos a la pared celular sin que medien procesos metabólicos) y la bioacumulación (proceso mediado por el metabolismo, en el cual los iones metálicos se acumulan dentro de la célula) (Mrvčić et al. 2012).

En la Figura 1, se observan los resultados de la tasa de supervivencia de S. cerevisiae LTw3 al tratamiento con H2O2 (50 mM). El control con adición de peróxido de hidrógeno mostró una reducción de la viabilidad del 64%, mientras que se observó un efecto protector mediante las suspensiones celulares tratadas térmicamente de las cepas de BAL ensayadas (P ≤ 0.05). La levadura S. cerevisiae es utilizada

para el estudio de viabilidad replicativa y cronológica celular; se considera un modelo biológico simple para la evaluación de actividad antioxidante, debido a su susceptibilidad al peróxido de hidrógeno (Lin et al. 2018). De acuerdo con los resultados de porcentaje de viabilidad, se destacan entre las cepas pertenecientes al género Enterococcus: E. hirae 471, E. faecium 452 y E. mundtii Tw56; y de las cepas que forman parte del género Lactococcus, se destaca L. lactis Tw12, todas con un efecto protector superior al 80%. Estos resultados son comparables con lo registrado por Lin et al. (2018), quienes obtuvieron un efecto protector del 79.91% para la cepa L. plantarum AR113. Sin embargo, se observan diferencias con lo obtenido por Kuda et al. (2014), quienes reportan un efecto protector menor al 70% para P. pentosaceus, L. lactis y cepas de L. plantarum.

Fig. 1 E. fm: Enterococcus faecium; E. fl: E. faecalis; E. mu: E. mundtii; E. hi: E. hirae; Lc. l: Lactococcus lactis; C1: control sin adición de H2O2; C2: control con adición de H2O2

Es importante destacar que no existe una relación directa entre las técnicas in vitro e in vivo de las BAL seleccionadas en este estudio. Entre las cepas evaluadas se resalta el comportamiento de E. hirae 108, que en los ensayos in vitro demostró ser potencialmente promisoria; pero, en el modelo in vivo presentó un menor efecto protector comparado con las restantes BAL. Contrariamente, la cepa L. lactis Tw12 exhibió un bajo porcentaje de secuestro de radicales DPPH, valores intermedios en los ensayos de secuestro de radicales oxidrilos y CUPRAC, mientras que en el modelo in vivo resultó ser una de las cepas con mayor efecto protector (89%). Datos similares son reportados en el trabajo de Kuda et al. (2014), en el cual la cepa P. pentosaceus S-SU6 presentó valores inferiores en los ensayos in vitro, pero demostró el mayor efecto protector frente al modelo eucariota de S. cerevisiae comparado con las cepas estudiadas en ese trabajo.

De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo y lo observado por otros autores (Łepecka et al. 2023), se podría considerar que la capacidad antioxidante es dependiente de la cepa; microrganismos identificados bajo la misma especie exhiben diferentes resultados, según las técnicas realizadas. Además, como lo han debido a los distintos sistemas de barrido de radicales presentes en los microorganismos. En futuros estudios, se deberían valorar los procesos de regulación enzimáticos relacionados con la actividad antioxidante, como también la naturaleza de los compuestos que otorgan dicha característica con potencial biotecnológico.

Mediante las evaluaciones in vitro e in vivo de los cultivos celulares de las 16 cepas provenientes de organismos marinos, se determinó que la capacidad antioxidante es variable y dependiente de las cepas e independiente del origen del aislamiento. Particularmente, las cepas E. hirae 471, E. faecium 452, E. mundtii Tw56 y L. lactis Tw12 podrían ser consideradas BAL promisorias para su utilización en alimentos funcionales, de acuerdo con su efecto protector evaluado en S. cerevisiae. Mientras que, las cepas E hirae 106, 107, 108, E mundtii 278, E faecium 465 y L. lactis Tw 35 se podrían utilizar como cultivos iniciadores en procesos fermentativos, debido a la producción de metabolitos con capacidad antioxidante, según lo obtenido en los ensayos in vitro. La capacidad antioxidante ejercida por las cepas bacteriocinogénicas de origen marino podría considerarse un rasgo metabólico adicional de selección para evaluar el potencial biotecnológico en procesos fermentativos y desarrollo de alimentos funcionales