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ISSN: 1659-455X • e-ISSN: 1659-407X REVMAR REVISTA CIENCIAS MARINAS Y COSTERAS
Recepción 9 marzo 2023 • Corregido 2 junio 2023 Capacidad antioxidante de bacterias lácticas aisladas de peces e invertebrados marinos de la provincia de Chubut, Patagonia-Argentina Antioxidant capacity of lactic acid bacteria isolated from marine fish and invertebrates of the province of Chubut, Patagonia, Argentina Franco M. Sosa1,2, Romina B. Parada1,2, María A. Sánchez-Cabrera1, RESUMEN La actividad antioxidante de las bacterias ácido lácticas (BAL) ha sido estudiada en profundidad en cepas aisladas de organismos terrestres, alimentos fermentados y sin procesar. Sin embargo, esta información en aislamientos de origen marino aún está siendo determinada. Tal característica presenta un interés particular, debido a su uso potencial en alimentos funcionales. En este trabajo, se estudió la capacidad antioxidante de 16 BAL bacteriocinogénicas provenientes de organismos marinos de la costa del Chubut (periodo 2010-2022), mediante ensayos in vitro e in vivo. Se evaluó la capacidad antioxidante in vitro por medio de la reducción de 2,2-difenil-1-picrihidrazilo (DPPH), actividad antioxidante reductora de iones cúpricos (CUPRAC) y barrido de radicales oxidrilos, empleando células sin lisar. Se utilizó Saccharomyces cerevisiae como modelo biológico eucariota para valorar el efecto protector in vivo. Los resultados obtenidos por secuestro de radicales DPPH exhibieron valores entre 15-37.5%; el ensayo de secuestro de radicales oxidrilos mostró valores entre 13.3-61.9% y el método CUPRAC los valores variaron entre 0.223-0.551, equivalentes a mmol de ácido ascórbico por ml de suspensión celular. El efecto protector de las BAL en la supervivencia de S. cerevisiae presentó valores entre 36-90%. No fue posible establecer relaciones entre los valores obtenidos por distintos métodos o entre miembros del mismo género o especie; por ello, la capacidad antioxidante podría considerarse una característica dependiente de la cepa. Los resultados sugieren que la capacidad antioxidante de BAL bacteriocinogénicas de origen marino podría usarse como un carácter metabólico de selección con potencial biotecnológico en el desarrollo de alimentos funcionales. Palabras clave: actividad antioxidante, alimentos funcionales, Enterococcus, Lactococcus, ambiente marino. ABSTRACT The antioxidant activity of lactic acid bacteria (LAB) has been studied in depth in strains isolated from terrestrial organisms and fermented or unprocessed foods; however, information on isolates of marine origin is still being determined. This feature is of particular interest due to its potential use in functional foods in this work. The antioxidant capacity of 16 bacteriocinogenic LAB isolated from marine organisms from the Chubut coast (2010-2022 period) was studied with in vivo and in vitro assays. The in vitro antioxidant capacity was assessed by reduction of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), cupric ion-reducing antioxidant capacity (CUPRAC), and hydroxyl radical scavenging in unlysed cells. Saccharomyces cerevisiae was used as a eukaryotic biological model to evaluate the protective effect in vivo. The antioxidant capacity results from the DPPH radical scavenging test exhibited values between 15-37.5%, while hydroxyl radical scavenging showed values between 13.3-61.9%, and, for the CUPRAC method, values varied between 0.223-0.551, equivalent to mmol of ascorbic acid per ml of cellular suspension. The LAB protective effect on the survival rate of S. cerevisiae displayed results between 36-90%. No relationship was established between the values obtained with the different methods or between members of the same genus or species; consequently, the antioxidant behavior could be considered strain-depend. Results suggest that the antioxidant capacity of bacteriocinogenic LAB of marine origin can be used as a metabolic selection trait with biotechnological potential in the development of functional foods. Keywords: antioxidant activity, functional foods, Enterococcus, Lactococcus, marine environment. Durante los últimos años, las características fisiológicas de la biota que habita el ambiente marino han despertado interés, debido a su potencial uso biotecnológico en diversas áreas (Feng et al. 2020; Kim et al. 2021). En Argentina, el ecosistema marino presenta no solo una gran extensión, sino también una alta biodiversidad. Sin embargo, los microorganismos que habitan estos ecosistemas han sido poco estudiados y su potencial biotecnológico, escasamente explorado (Dionisi et al. 2012). Las bacterias ácido lácticas (BAL) se han utilizado para elaborar y conservar alimentos desde el comienzo de la civilización, por la capacidad de producir ácidos orgánicos que logran su preservación, así como en el desarrollo de características organolépticas. Las BAL pueden presentarse en forma fortuita como microbiota natural de los alimentos o incorporarse de manera controlada en fermentaciones industriales como cultivos iniciadores (Łepecka et al. 2023). El estudio en profundidad del metabolismo de las BAL ha permitido seleccionar cepas con características funcionales para su aplicación en alimentos (Kuda et al. 2014; Lin et al. 2018). El término “alimento funcional” se introdujo por el Gobierno de Japón a mediados de 1980 (Granato et al. 2020) y se define como productos utilizados como parte de una dieta normal con efectos más allá de sus funciones nutricionales básicas. El mercado de alimentos funcionales está en continuo crecimiento, en relación con productos dirigidos a la salud gastrointestinal, enfocado, particularmente, en los pre-bióticos y probióticos (Annuziata & Vecchio, 2013). El desbalance entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) y/o radicales libres y la dificultad de su eliminación por sistemas antioxidantes genera el estrés oxidativo de un organismo (Łepecka et al. 2023). Las modificaciones por reacciones de oxidación que sufren el ADN, proteínas, lípidos y otras moléculas pequeñas por ROS desempeñan un papel importante en el desarrollo de enfermedades comunes y afecciones degenerativas relacionadas con la edad (Wen et al. 2013; Kuda et al. 2014). Durante los últimos años, ha tomado un especial interés la búsqueda de nuevos antioxidantes que sean seguros para su uso en alimentos; en particular las BAL y sus metabolitos se han reconocido como fuentes efectivas. La mayoría de las BAL tiene sistemas que eliminan los radicales libres de oxígeno, reducen su acumulación e incluso previenen su formación en el intestino, disminuyendo el estrés oxidativo (Łepecka et al. 2023). El litoral marino de la Argentina constituye una fuente de BAL, provenientes de distintos vertebrados e invertebrados, que exhiben propiedades biotecnológicas aplicables en la industria alimentaria, tales como actividad antimicrobiana (Marguet et al. 2011; Sosa et al. 2022), producción de bioemulsificantes (Gianni de Carvalho et al. 2019; Lara et al. 2020), características probióticas (Sequeiros et al. 2010), entre otras. A lo largo de los últimos años, se ha profundizado el estudio de la capacidad antioxidante de BAL provenientes de organismos terrestres y alimentos fermentados o sin procesar; no obstante, es escasa la información sobre cepas de origen marino. En el presente estudio, se evaluó la capacidad antioxidante in vivo e in vitro de cepas de BAL bacteriocinogénicas aisladas de invertebrados y peces marinos de la costa de la provincia de Chubut (Argentina), para su posterior selección como cultivos iniciadores en alimentos funcionales. Se seleccionaron 16 cepas de BAL provenientes de invertebrados y peces marinos (Cuadro 1) de la costa de la provincia de Chubut (Patagonia-Argentina), sobre la base de su actividad antimicrobiana contra patógenos o contaminantes de alimentos de interés para la industria pesquera. Se utilizaron las cepas Enterococcus hirae 106, 107, 108, 463 y 471; E. faecium 135, 452, 459, 465 y 468, y E. mundtii 278 (Sosa et al. 2022); Lactococcus lactis Tw11, 12, 34 y 35 (Vallejo et al. 2009); y E. mundtii Tw56 (Schelegueda et al. 2015), pertenecientes al cepario del Laboratorio de Biotecnología Bacteriana (LBB), Cátedra de Biología Celular y Molecular, FCNyCS, UNPSJB- Sede Trelew. Cuadro 1. Fuente y origen del aislamiento de las cepas de BAL seleccionadas para la realización del estudio Table 1. Source and origin of isolation of selected LAB strains for the study
Para los experimentos subsecuentes, las cepas se cultivaron en 2 ml de caldo Man Rogosa Sharpe (MRS) (Biokar, Francia) a 35°C, durante 18 h sin agitación. Las células intactas se obtuvieron mediante centrifugación a 2 000 g durante 15 min y lavado con buffer PBS, procedimiento realizado dos veces. La capacidad antioxidante en células intactas se determinó in vitro, con la técnica de actividad antioxidante por reducción de 2,2-difenil-1-picrihidrazilo (DPPH), reacción de secuestro de radicales oxidrilos y la capacidad antioxidante reductora de iones cúpricos (CUPRAC). Además, se evaluó in vivo el efecto protector de las BAL contra el peróxido de hidrógeno, por medio del uso de Saccharomyces cerevisiae como modelo eucariota. Actividad antioxidante por reducción de 2,2-difenil-1-picrihidrazilo (DPPH) El ensayo de DPPH se realizó según lo propuesto por Zhang et al. (2013). Las células se resuspendieron con 2 ml de la solución de DPPH y se incubaron en oscuridad durante 30 min. Luego de centrifugar a 6 000 g durante 5 min, se midió la absorbancia de los sobrenadantes a 517 nm, utilizando un espectrofotómetro (Jenway 6405 UV/Vis). El porcentaje de reducción del DPPH se calculó a partir de la siguiente fórmula:
Acontrol (absorbancia de la solución de DPPH); y Amuestra (DPPH con suspensión celular). Capacidad antioxidante reductora de iones cúpricos (CUPRAC) Se resuspendieron las células en 3 ml de reactivo de trabajo compuesto de la siguiente manera: 1 ml neocuproina (1 mg*ml en etanol-1), 1.5 ml de buffer acetato de sodio (0.05 M y pH 6.0) y 0.5 ml de solución de CuCl2 (0.01 M). Se incubó en oscuridad durante 1 h y se centrifugó a 12 000 g durante 2 min. Finalmente, se midió la absorbancia del sobrenadante a 450 nm y los resultados se expresaron como mmol equivalentes de ácido ascórbico por ml de suspensión (mmol ácido ascórbico*ml de suspensión-1), según lo propuesto por Apak et al. (2004). Actividad antioxidante por secuestro de radicales oxidrilos Se realizó el ensayo, acorde con el protocolo establecido por Zhang et al. (2021), con algunas modificaciones: se resuspendieron las células en la mezcla de reacción compuesta por 1 ml de 1,10-fenantrolina (0.75 mM), 1 ml de FeSO4 (0.75 mM) y 2 ml de buffer fosfato de sodio (0.2 M). Se adicionó 1 ml de H2O2 (0.01% v/v) al inicio de la reacción y se incubó durante 90 min a 37°C. Posteriormente, se centrifugó a 12 000 g durante 4 min y se midió la absorbancia a 508 nm. Se calculó el porcentaje de secuestro de radicales OH• mediante la siguiente fórmula:
Ablanco: absorbancia de la mezcla de reacción; Acontrol: absorbancia de la mezcla de reacción y peróxido de hidrógeno; y Amuestra: absorbancia de la mezcla de reacción y el cultivo celular. Actividad antioxidante in vivo Se evaluó el efecto protector de las BAL frente a la toxicidad oxidativa de H2O2 sobre Saccharomyces cerevisiae LTw3, a través del método propuesto por Lin et al. (2018) con modificaciones. El pellet de BAL se resuspendió en 2 ml de agua destilada estéril. Luego, se añadieron 600 µl de cada suspensión de BAL a 5 ml de agua destilada estéril y se calentó a 100°C durante 20 min. Cuando la temperatura descendió a un rango de 30-35°C, se agregaron 50 µl de un cultivo de S. cerevisiae LTw3 y se incubó durante 90 min. Seguidamente, se adicionaron 280 µl de H2O2 (50 mM). Se realizaron dos controles en ausencia de BAL: uno para evaluar el efecto del H2O2 sobre la viabilidad de los organismos (C2) y otro sin el agregado de H2O2 para valorar el crecimiento de la levadura (C1). Posterior a la adición de H2O2, las suspensiones se incubaron durante 90 min a 35°C. Después de este tratamiento, se tomaron 100 µl de las suspensiones y se diluyeron en 5 ml de agua destilada estéril. Se sembraron 100 µl de las diluciones en agar GPY (Difco, EE. UU.) y se incubaron durante 48 h a 35°C, para su posterior recuento. Con el fin de determinar la tasa de supervivencia de la levadura S. cerevisiae, se utilizó la siguiente relación:
*Cultivo de levaduras, con agregado de peróxido de hidrógeno y suspensión de BAL tratadas térmicamente descritas por Kuda et al. 2014. Todos los ensayos se realizaron de manera independiente y por triplicado. Los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANDEVA) y las diferencias significativas entre las medias se determinaron mediante el test de Tukey (P ≤ 0.05). Se utilizó el software estadístico STATGRAPHICS Centurion XV (StatPoint Technologies, Inc. 2006). Los microorganismos que presentan capacidad antioxidante, mediante la producción de metabolitos y/o presencia de componentes en su superficie celular, podrían disminuir o anular el efecto negativo de los ROS (Bhagwat & Annapure, 2019). En este estudio, se evaluaron diferentes ensayos in vitro. En el Cuadro 2, se observan los porcentajes de barrido de DPPH y radicales oxidrilos, comprendidos entre un 15-37.5% y 13.3-61.9%, respectivamente. Cuadro 2. Determinación de la actividad antioxidante de las células de BAL seleccionadas por métodos DPPH y secuestro de radicales oxidrilos Table 2. Determination of antioxidant activity of LAB cells selected using the DPPH and scavenging of hydroxyl radicals methods
Los resultados obtenidos equivalen al promedio y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. La evidencia de actividad antioxidante por el método de DPPH se observa por medio de la interacción de radicales libres con compuestos de carácter antioxidante donantes de protones, que ocasiona un descenso en la absorbancia con respecto al control (Bhagwat & Annapure, 2019). A partir de los resultados obtenidos de DPPH, se pueden agrupar las siguientes cepas, en función de su mayor capacidad antioxidante: E faecium 459 y 465, E. mundtii 278 y E. hirae 106 y 108, todas ellas provenientes de invertebrados marinos, que presentan diferencias significativas con las demás cepas pertenecientes al género (P ≤ 0.05). En el género Lactococcus, la cepa L. lactis Tw 35, proveniente del tegumento de Odonthesthes platensis, exhibe una mayor capacidad antioxidante (P ≤ 0.05). Las restantes BAL evaluadas presentan variaciones en los resultados, independientemente de la cepa y el organismo de origen del aislamiento. Resultados similares fueron obtenidos por Bhagwat & Annapure (2019), quienes evaluaron la actividad antioxidante por medio de la técnica de DPPH en cepas de Enterococcus de origen humano, con valores variables para las especies evaluadas. A diferencia de lo obtenido en este estudio, las cepas evaluadas por Rezaei et al. (2020) exhiben una capacidad antioxidante entre 40-60% para Lactococcus lactis y de 58% para Enterococcus faecium aislados de leche de camello. La reacción de Fenton se basa en la oxidación de iones Fe2+ a Fe3+ mediada por la acción del peróxido de hidrógeno, lo cual da como resultado radicales OH•. Estas especies reactivas del oxígeno ocasionan daños en el ADN y producen la peroxidación de lípidos (Lin et al. 2018). A partir del análisis de los datos de barrido de radicales oxidrilos, se destaca la cepa E. faecium 452, aislada de Mytilus edulis platensis, que presentó un 62% de actividad antioxidante, significativamente diferente al resto de las especies estudiadas pertenecientes al género Enterococcus (P ≤ 0.05). Este resultado supera al porcentaje obtenido por Lin et al. (2018) para cepas de Lactobacillus plantarum, con valores de secuestro de radicales oxidrilos en un rango entre 7.08-49.60%, y Pediococcus pentosaceus, de 26.45%. También podemos destacar como microorganismos promisorios a E. hirae 107 con actividad antioxidante de un 40.9% y E. hirae 108 con 44.8%, aisladas de pepino de mar (Hemiodema spectabilis) y de estrella de mar (orden Forcilulatida), respectivamente. En relación con el género Lactococcus, se destaca L. lactis Tw 12, que exhibió un porcentaje de secuestro de radicales oxidrilos de 28.7%, valor notablemente distinto, comparado con las demás cepas pertenecientes al género (P ≤ 0.05). Se debe resaltar que L. lactis Tw 35 mostró mayor capacidad antioxidante en DPPH, comparado con integrantes de su mismo género; sin embargo, se obtuvo uno de los valores más bajos cuando se utilizó la técnica de secuestro de radicales oxidrilos. En las demás cepas ensayadas, se obtuvieron valores variables, independientemente del género y de la especie, como también del organismo del que fueron aislados. En el Cuadro 3, se observan los resultados de capacidad antioxidante determinados por el método CUPRAC. Las cepas exhiben una capacidad antioxidante entre 0.233-0.551 equivalentes mmol de ácido ascórbico*ml de suspensión-1. En el género Enterococcus, se destacan las cepas de E. mundtii Tw56 aislada de O. platensis, E. hirae 108 y E. faecium 465, ambas provenientes de invertebrados marinos; mientras que para el género Lactococcus, la cepa L. lactis Tw12 aislada de O. platensis exhibió la mayor capacidad antioxidante (P ≤ 0.05). Las restantes cepas de BAL evaluadas presentan variaciones en los resultados, independientemente del género, de la especie y del organismo de aislamiento (peces o invertebrados). Cuadro 3. Determinación de actividad antioxidante de las células de BAL seleccionadas por el método CUPRAC Table 3. Determination of antioxidant activity of LAB cells selected using the CUPRAC method
Los resultados obtenidos equivalen al promedio y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Las medias con diferentes letras indican diferencias significativas (P ≤ 0.05). Los resultados obtenidos equivalen al promedio y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Las medias con diferentes letras indican diferencias significativas (P ≤ 0.05). El ensayo CUPRAC es un método utilizado para el análisis de la actividad antioxidante de matrices alimentarias y extractos biológicos. Está basado en una transferencia simple de electrones y mide el poder reductor de los compuestos antioxidantes para convertir los iones Cu2+ a Cu+. Este es considerado una variación del ensayo FRAP, con el cual se evalúa la reducción del ion Fe+3 a Fe+2 (Shahidi & Zhong, 2015). Mu et al. (2019) realizaron un ensayo con células intactas, mediante la técnica FRAP, para examinar la actividad antioxidante de la cepa L. plantarum Y44. No obstante, sus resultados no serían comparables con los obtenidos en este trabajo, debido a las diferencias entre los iones metálicos, como también al pH del medio utilizado para la reacción, ya que la técnica FRAP es efectuada en un medio ácido (pH = 3.6) y el ensayo CUPRAC es llevado a cabo a pH neutro. Este último podría simular de mejor manera la acción fisiológica de la actividad antioxidante (Özyürek et al. 2011). Las BAL, como otros microorganismos, presentan la capacidad de capturar iones metálicos, que se unen a la pared celular o polisacáridos extracelulares, mediante la adsorción, cambios iónicos, formación de complejos, quelación o microprecipitación. El secuestro de iones metálicos ocurre por biosorción (la unión de iones metálicos a la pared celular sin que medien procesos metabólicos) y la bioacumulación (proceso mediado por el metabolismo, en el cual los iones metálicos se acumulan dentro de la célula) (Mrvčić et al. 2012). En la Figura 1, se observan los resultados de la tasa de supervivencia de S. cerevisiae LTw3 al tratamiento con H2O2 (50 mM). El control con adición de peróxido de hidrógeno mostró una reducción de la viabilidad del 64%, mientras que se observó un efecto protector mediante las suspensiones celulares tratadas térmicamente de las cepas de BAL ensayadas (P ≤ 0.05). La levadura S. cerevisiae es utilizada para el estudio de viabilidad replicativa y cronológica celular; se considera un modelo biológico simple para la evaluación de actividad antioxidante, debido a su susceptibilidad al peróxido de hidrógeno (Lin et al. 2018). De acuerdo con los resultados de porcentaje de viabilidad, se destacan entre las cepas pertenecientes al género Enterococcus: E. hirae 471, E. faecium 452 y E. mundtii Tw56; y de las cepas que forman parte del género Lactococcus, se destaca L. lactis Tw12, todas con un efecto protector superior al 80%. Estos resultados son comparables con lo registrado por Lin et al. (2018), quienes obtuvieron un efecto protector del 79.91% para la cepa L. plantarum AR113. Sin embargo, se observan diferencias con lo obtenido por Kuda et al. (2014), quienes reportan un efecto protector menor al 70% para P. pentosaceus, L. lactis y cepas de L. plantarum.
E. fm: Enterococcus faecium; E. fl: E. faecalis; E. mu: E. mundtii; E. hi: E. hirae; Lc. l: Lactococcus lactis; C1: control sin adición de H2O2; C2: control con adición de H2O2. Fig. 1. Actividad antioxidante in vivo de las cepas seleccionadas. Los resultados obtenidos equivalen al promedio y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Las medias con diferentes letras indican diferencias significativas (P ≤ 0.05) Fig. 1. In vivo antioxidant activity of selected strains. Results obtained are equivalent to the average and standard deviation of three independent assays. The means with different letters correspond to significant differences (P ≤ 0.05) Es importante destacar que no existe una relación directa entre las técnicas in vitro e in vivo de las BAL seleccionadas en este estudio. Entre las cepas evaluadas se resalta el comportamiento de E. hirae 108, que en los ensayos in vitro demostró ser potencialmente promisoria; pero, en el modelo in vivo presentó un menor efecto protector comparado con las restantes BAL. Contrariamente, la cepa L. lactis Tw12 exhibió un bajo porcentaje de secuestro de radicales DPPH, valores intermedios en los ensayos de secuestro de radicales oxidrilos y CUPRAC, mientras que en el modelo in vivo resultó ser una de las cepas con mayor efecto protector (89%). Datos similares son reportados en el trabajo de Kuda et al. (2014), en el cual la cepa P. pentosaceus S-SU6 presentó valores inferiores en los ensayos in vitro, pero demostró el mayor efecto protector frente al modelo eucariota de S. cerevisiae comparado con las cepas estudiadas en ese trabajo. De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo y lo observado por otros autores (Łepecka et al. 2023), se podría considerar que la capacidad antioxidante es dependiente de la cepa; microrganismos identificados bajo la misma especie exhiben diferentes resultados, según las técnicas realizadas. Además, como lo han sugerido Bhagwat & Annapure (2019), se deben realizar diferentes métodos para evaluar la actividad antioxidante, debido a los distintos sistemas de barrido de radicales presentes en los microorganismos. En futuros estudios, se deberían valorar los procesos de regulación enzimáticos relacionados con la actividad antioxidante, como también la naturaleza de los compuestos que otorgan dicha característica con potencial biotecnológico. Mediante las evaluaciones in vitro e in vivo de los cultivos celulares de las 16 cepas provenientes de organismos marinos, se determinó que la capacidad antioxidante es variable y dependiente de las cepas e independiente del origen del aislamiento. Particularmente, las cepas E. hirae 471, E. faecium 452, E. mundtii Tw56 y L. lactis Tw12 podrían ser consideradas BAL promisorias para su utilización en alimentos funcionales, de acuerdo con su efecto protector evaluado en S. cerevisiae. Mientras que, las cepas E hirae 106, 107, 108, E mundtii 278, E faecium 465 y L. lactis Tw 35 se podrían utilizar como cultivos iniciadores en procesos fermentativos, debido a la producción de metabolitos con capacidad antioxidante, según lo obtenido en los ensayos in vitro. La capacidad antioxidante ejercida por las cepas bacteriocinogénicas de origen marino podría considerarse un rasgo metabólico adicional de selección para evaluar el potencial biotecnológico en procesos fermentativos y desarrollo de alimentos funcionales. Annuziata, A. & Vecchio, R. (2013). Consumer perception of functional foods: A conjoint analysis with probiotics. Food Qual. Prefer., 28(1), 348-355. https://doi.org/10.1016/j.foodqual.2012.10.009 Apak, R., Güçlü, K., Özyürek, M. & Karademir, S. E. (2004). Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC Method. J. Agric. Food Chem., 52, 7970-7981. https://doi.org/10.1021/jf048741x Bhagwat, A. & Annapure, U. S. (2019). In vitro assessment of metabolic profile of Enterococcus strains of human origin. J. Genet. Eng. Biotechnol., 17(11), 1-11. https://doi.org/10.1186/s43141-019-0009-0 Dionisi, H., Lozada, M. & Olivera, N. 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